TINCIÓN DE GRAM

Universidad Latina De Panamá

Facultad Ciencias De La Salud

Licenciatura en Farmacia

¨Tinción De Gram¨

III Cuatrimestre

Profesor Ricardo Vizuete

Integrantes: 

Alicia Cheung 

Katiuska Guan

Mileika Lineth

Ariel Ledezma

Maribel Len

Isabel Luo

Juan Montes
Magda Rodriguez

Nayeli  Garcias

Melissa Wan

Yamilka Yau

Diciembre de 2015 




Tinción de Gram

INTRODUCCIÓN

TINCIÓN DE GRAM.

          Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en muestras clínicas. También se emplea como primer paso en la diferenciación bacteriana. El examen con microscopio óptico de preparación con tinción de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos ( esféricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas

         

Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los microorganismos Gram. positivos se tiñen de azul, mientras que aproximadamente  un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espiralados se tiñen de rojo y se dice que son gramnegativos.

        Las aplicaciones más comunes  de la coloración de Gram son las siguientes:

La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos 

La presencia de diplococos gramnegativos son características de especies de Neisseria

Los bacilos Gram. positivos grandes sugieren especies de Bacillus o clostridium, los bacilos Gram. positivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes ( difteroides)

        Los bacilos Gram. negativos son las bacterias mas comunes halladas en los laboratorios clínicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y  especies de Haemophilus.

         El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.

OBJETIVO

          El alumno aplicará una  técnica  de coloración diferencial para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

MATERIAL

• Asa de platino 
• Microscopio
• Porta objetos
• Aceite de inmersión 
• Esputo de tuberculoso procesado en autoclave
• Cultivos de Escherichia coli                                                     
• Cultivo de Staphylococcus aureus
• Cultivo de Cándida albicans

  

SUSTANCIAS COLORANTES

• Colorante violeta cristal de Gram                               
• Solución decolorante alcohol  acetona                                    
• Safranina de Gram
• Yodo de Gram o lugol para gram

PROCEDIMIENTO

REALIZACIÓN DEL FROTIS

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.

A)    TINCIÓN  DE GRAM

1. Realiza la preparación del  frotis bacteriano como se explicó  en el paso anterior
2. Teñir con cristal violeta 3 min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con  Lugol 1min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.

RESULTADOS

CUESTIONARIO

1.      ¿Qué es un frotis?

: Frotis es la realización de extensión tomando una pequeña cantidad de cultivo bacteriano extendiéndola sobre un portaobjetos limpio y fijándola.

2.      ¿Con que finalidad se fija la muestra de microorganismo en el porta objetos?

: La fijación de una extensión bacteriana es imprescindible para que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio. De esta manera, no se pierden en los pasos de lavado necesarios para la tinción.

3.      ¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?

:Es difícil su observación sin teñir las bacterias. Las tinciones se usan para revelar el tamaño, las forma y la agrupación de los microorganismos. Para mostrar la presencia de varias estructuras internas y externas y para producir reacciones físicas y químicas especificas a las tinciones, ayudar a la identificación de los microorganismos.

4.      ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los microorganismos?

: El aceite de inmersión es usado para la observación objetivo muy pequeño, como las muestras individuales de bacterias y para la aplicación de alta resolución.

5.      De los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿Cuál es el que funciona como colorante primario?

: Se utilizó cristal violeta, colorante violeta que imparte su color a todas las células como un colorante primario.

6.      ¿Que función tiene el Yodo en la tinción de Gram?

: Se le agregó yodo una sustancia química a la solución para intensificar la coloración; este aditivo se denomina mordiente para dar como resultado una coloración violeta oscuro.

7.      ¿Qué coloración tiñe las bacterias Gram, positiva?

: Las bacterias que retienen el cristal violeta después de la decoloración se observan de color morado y son Gram positiva.

8.      ¿Que coloración tiñen las bacterias Gram negativas?

: Las bacterias Gram negativas por el contrario, pierden el colorante primario por el tratamiento diferencial y toman el colorante de contraste, se observa entonces de color rojo.

9.      Menciona tres bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.

: Bacteria de Gram positiva:

·       Bacillus anthracis: produce una enfermedad infecciosa debido a un tipo de bacterias llamadas Bacillus anthracis. La infección en los humanos compromete con mayor frecuencia la piel, el tracto gastrointestinal o los pulmones. Ántrax cutáneo (piel): es la forma más frecuente; en Chile el 95% de los casos es de este tipo. El contagio se produce cuando la bacteria toma contacto con un corte o lesión de la piel, al manipular cuero, lana, pelo de animales infectados. Comienza con un granito y picazón parecido a la picadura de un insecto. Pronto se convierte en una úlcera indolora, entre 1 y 3 centímetros de diámetro, generalmente negra en el centro. Los ganglios de la zona cercana se pueden inflamar. Los sitios más frecuentemente comprometidos son la cabeza, antebrazos y manos. Las infecciones no tratadas pueden derivar en una septicemia masiva y en ocasiones causa meningitis. Alrededor de un 20% de los casos que no reciben tratamiento mueren.

·         Clostridium botulinum: causante de la enfermedad botulismo.     El Botulismo del lactante se debe a la acción de la neurotoxina que colonizan el aparato digestivo de los lactantes debido a la ausencia de microorganismos intestinales competidores, puede desarrollar una enf. Progresiva con parálisis fláccida e insuficiencia respiratoria. El botulismo alimentario suele presentar un cuadro de debilidad y mareos 1 a 2 días después del consumo del alimento contaminado, los signos iniciales de la enfermedad son visión borrosa, pupilas fijas y dilatadas, xerostomía y dolor abdominal, en el Botulismo de las heridas la producción de la toxina del Clostridio produce síntomas idénticos al de los alimentos pero el periodo de incubación es más largo de 4 días o mas y los síntomas del aparato digestivo son menos prominentes.

·         Corynebacterium diphtheriae: causante de la Difteria respiratoria      Los síntomas de la difteria que afectan al aparato respiratorio se desarrollan después de un periodo de incubación de 2 a 4 días. La bacteria se multiplica en el interior de células epiteliales de la faringe o de superficies adyacentes e inicialmente produce un daño localizado como consecuencia de la actividad de la exotoxina.Comienzo brusco con faringitis exudativa, garganta irritada, febrícula y malestar, se forma una seudomembrana sobre la faringe, en enfermos en estado crítico las complicaciones más significativas son cardiacas y neurológicas.

10.  Menciona tres bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.

: Bacteria de Gram negativa

·         H. pylori: La bacteria causa las úlceras pépticas al dañar el revestimiento mucoso que protege el estómago y el duodeno. El daño al revestimiento mucoso permite que los potentes ácidos estomacales atraviesen el sensible revestimiento debajo del estómago y duodeno. Juntos, el ácido estomacal y H. pylori irritan el revestimiento del estómago y duodeno y causan una úlcera.

·         -Haemophilus influenzae: Esta bacteria causante de las siguientes enfermedades:   1. Meningitis: Fiebre, dolor de cabeza, náusea, vómitos, cuello rígido, sensibilidad a la luz (fotofobia), convulsiones, coma; en niños, pobre alimentación y abultamiento de la fontanela. 2. Epiglotitis: Establecimiento repentino de dolor de garganta, fiebre y cortedad de respiración, que progresa rápidamente a dificultad al tragar, acumulando saliva y babeo debido a la vía aérea obstruida. 3 Neumonía: Dificultad respiratoria severa, taquicardia, fiebre, tos y evidencia de neumonía por rayos X. 4. Artritis Séptica: Edema, calor, dolor al movimiento y movilidad disminuida de una sola articulación mayor.

·         Brucella: El periodo de incubación dura de una a seis semanas. El inicio de las manifestaciones clínicas se caracteriza por fiebre, artralgias, mialgias y diaforesis. Las manifestaciones clínicas dependen de la vía de transmisión del organismo: si es respiratoria, el paciente cursa con neumonía, si entra por la piel las manifestaciones incluyen celulitis y linfadenopatía regional. Los microorganismos pueden luego diseminarse a otros tejidos vía sanguínea. Síndrome febril, Osteoarticulares, síndrome depresivo, nerviosismo, esplenomegalia, hepatomegalía, hepatitis.

INVESTIGACIÓN

1.      Cuáles son las fuentes de  errores más comunes de error en la tinción de Gram

: Errores comunes en la tinción de Gram

·         Identificación y toma de la muestra que no las bacterias.

·         Sobrecalentar el portaobjeto, puede distorsionar y causar un efecto en la muestra

·         Emplear mal las técnicas requerida durante el proceso de tinción

·         Concentración inadecuada de los reactivos de tinción.

·         El tiempo de tinción incorrecto.

2.      Explique que reacción de Gram darán las levaduras. Estas tendrán la misma importancia que para las bacterias.

: La tinción de Gram tiñe la levadura, en casi todas son Gram positivo. Son de la misma importancia ya que las bacteria levaduras también pueden ser infecciosas para el ser humano y se usan para diagnóstico en laboratorio clínico.

3.      Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica. Qué tipo de información se obtiene.

R: El preparado incoloro contra un fondo coloreado se denomina tinción negativa. Una técnica valiosa para la observación de las formas generales, los tamaños y las cápsulas celulares resultan muy visibles contra un fondo oscuro que contrasta.

4.      Investiga otra técnica de tinción selectiva que permita observar otras estructuras bacterianas.

: Tinción de ziehl-neelsen

La tinción de ziehl neelsen es otro tipo de coloración diferencial que separa los géneros mycobacterium y nocardia del resto de las bacterias.

En esta técnica se utiliza fucsina o fenicada como colorante primario, esta solución se aplica son calentamiento o emisión de vapores. Como agente decolorante se aplica una mezcla de etanol y ácido sulfúrico o ácido clorhídrico, el azul de metileno es el colorante secundario.

La coloración clásica de ziehl-neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante a no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

5.      ¿A qué se debe el distinto comportamiento de las bacterias según se Gram + o Gram-?

R: La capa de peptidoglucano de la pared celular bacteriana, juegan un papel fundamental en la coloración: el cristal violeta y el lugar, forma una laca en el interior de las bacterias. Al aplicar el agente decolorante.

En las bacterias Gram positivas sufren una deshidratación y la red de peptidoglucano que es muy abundante, se condensa y constituye un obstáculo para la salida del complejo cristal violeta-lugol (yodo).

Las bacterias Gram negativas también posee peptidoglucano pero menos cantidad por lo que constituye una barrera laxa, de modo que las bacterias quedan más permeable que las Gram positivas y el complejo cristal violeta-lugol (yodo) sale con más facilidad dejando lugar a la safranina. .

6.      ¿Para qué se necesita el aceite de inmersión?

: El aceite de inmersión para microscopio tienen el mismo índice de refracción que el vidrio. Mediante el aceite de inmersión se elimina completamente la desviación de los rayos de la luz y aumenta con eficacia los objetos de los microscopios.

CONCLUSIÓN

La tinción empleada  en microbiología para la visualización de bacterias en muestras clínicas. Se emplean para la diferenciación bacterianas, esta preparación con tinción de Gram se emplean para la determinar la forma de las bacterias, las formas comunes son cocos (esféricos), bacilos (alargadas) y forma espiraladas. Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los microorganismos Gram positivas se tiñen de azul, mientras que las Gram negativas son de rojo. Es pues de importancia  la tinción de Gram  emplear métodos de coloración de las bacterias para identificación y taxonomía de las bacterias.