Aislamiento de bacterias mediante el método siembra en placa por estrias

Universidad Latina De Panamá

Facultad Ciencias De La Farmacia

Licenciatura en Farmacia

¨Aislamiento de bacterias mediante el método siembra en placa por estrías¨

III Cuatrimestre

Profesor Ricardo Vizuete

Integrantes: 

Alicia Cheung 

Katiuska Guan

Mileika Lineth

Ariel Ledezma

Maribel Len

Isabel Luo

Juan Montes
Magda Rodruigez

Nayeli  Garcias

Melissa Wan

Yamilka Yau

Diciembre de 2015 

AISLAMIENTO DE  BACTERIAS  MEDIANTE EL MÉTODO SIEMBRA EN PLACA POR ESTRÍAS

INTRODUCCIÓN

        La piel (en condiciones normales) es una barrera que impide la penetración de los gérmenes, por ello actúa como mecanismo de defensa. Los mamíferos son frecuentemente infectados por algunas de las bacterias preexistentes en su medio ambiente, aunque en general viven en  equilibrio  con estos microorganismos, manteniéndoles limitados a zonas relativamente superficiales de su organismo. Sin embargo las bacterias infecciosas producen enfermedades al invadir tejidos más profundos. Por lo tanto para mantener la salud, el huésped debe defenderse constantemente frente a la invasión por parte de las bacterias.

         Los factores mecánicos, químicos y microbianos desempeñan un papel importante al restringir la colonización de las bacterias a las  superficies  corporales.

Ø  Factores mecánicos: Las superficies epiteliales de la piel y de las mucosas constituyen barreras que resultan más o menos impermeables a las bacterias. La impermeabilidad de la piel es mayor  que en la mayoría de las mucosas. Cuando se altera la integridad de la superficie epitelial, pueden desarrollarse infecciones subcutáneas. Las bacterias que causan más frecuentemente estas infecciones son las que existen habitualmente en la superficie cutánea, folículos pilosos y glándulas sudoríparas en la piel, es decir los estafilococos. 

Ø  Factores químicos: La acidez de las secreciones gástricas mantienen sin duda la esterilidad habitual del estómago. El Ph bajo de la piel (3-5), debido en gran parte  a los productos ácidos del metabolismo bacteriano, frena sin duda el crecimiento de muchos microorganismos que toman contacto con sus superficie

Ø  Factores microbianos: El antagonismo microbiano inhibe el crecimiento de muchas bacterias y hongos potencial mente patógena en lugares superficiales donde de no ser así, podrían producirse enfermedades.

             La flora de la región faríngea presenta problemas peculiares para el aislamiento e identificación de microorganismos, por lo tanto se refiere a los componentes de la flora normal como a microorganismos con acción patógena. Es importante recordar que algunos microorganismos tienen capacidad patógena definida y su presencia es un indicio claro de enfermedades, en tanto que otros, llamados oportunistas, guardan una posición  ambigua y pueden encontrarse tanto como componentes de la flora normal, como asociados a procesos patológicos, causados por otros microorganismos que son verdaderos responsables (por ejemplo los virus)  Los estafilococos están entre las primeras bacterias que se reconocieron como patógenas, y se descubrieron por primera vez a principios de la década de1880.

           Se encuentran ampliamente distribuidos por la naturaleza, y a menudo forman parte de la flora bacteriana de la piel y el tracto respiratorio superior; muchas de las especies que se encuentran en el hombre son comensales. La especie predominante patógena para  el hombre es el staphylococcus aureus, constituye la causa más común de las infecciones supurativas para el hombre. El aislamiento de S. aureus a partir del exudado faríngeo y exudado de piel, no tiene importancia diagnóstica, ya que se considera parte de la flora normal de la faringe y nasofaringe, por lo que no tiene significado clínico.

OBJETIVOS

Demostración de los medios de defensa del huésped en la piel y garganta mediante el método de siembra en placa por estría.

 MATERIALES

v  Cajas de petri con Agar- Sangre (GS)                                    

v   Exudado faringeo

v  Cajas de petri con Manitol sal Agar  (MSA)

v  Caja  de petri con Mconkey    (Mcc)                                      

v   Solución salina estéril

v  Cajas de petri con Agar vogel  y Jonson (AVJ)                            

v   Raspado de piel

v  Cajas de petri con Agar Estafilococo S110

v  Mechero Fisher

v  Asa de platino

v  Hisopos estériles

PROCEDIMIENTO

Raspado de piel

1.- Limpiar  y esterilizar el área a trabajar con fenol al 5%

2.- Prender el mechero fischer cerca de donde se va a trabajar, si es posible colocar otro

3.- Humedecer el hisopo en solución salina estéril, pasarlo sobre la superficie de la piel (con o sin pelo)

4.- Descargar el hisopo en dos  cajas  de petri con el medio ya preparado. (Es recomendable que para  cada dos cajas se utilice un solo hisopo con muestra). No retires completamente las tapas de los medios de cultivo para evitar que se contaminen

5.- quemar el hisopo y tirarlo.

6.- Esteriliza el Asa de platino hasta el rojo vivo, enfríalo introduciéndolo  en  un extremo del Agar

7.- Realiza el sembrado de los microorganismos por el método de  estría utilizando el asa y como se muestra en la figura. Evita destapar completamente la tapa de los medios de cultivo.

8- Repetir  el mismo proceso con otro hisopo  estéril y con solución salina para otras  dos cajas. Siembra por estría utilizando el Asa de platino y así hasta que se terminen de sembrar todos los medios preparados.

9.- Incubar  a  37ºC por  24-48 horas y observar resultados.

10.- Repite el mismo procedimiento pero ahora toma muestra de la faringe  con hisopos estériles en las zonas afectadas como: amígdalas, pared posterior  de la faringe, en general cualquier área que manifiesta signos de inflamación, exudados  y úlceras,  procurando no tocar con el hisopo la lengua.

Toma de la muestra

·         Se abre con cuidado, por un extremo, el depresor de madera, sin tocar el otro extremo para mantenerlo estéril.

·         Distribuidos por parejas, uno de los miembros de la pareja sujeta con el depresor la lengua del otro, colocándola pegada al suelo de la boca, manteniendo despejada la abertura bucal.

·         CON CUIDADO, se introduce una torunda y se tocan suavemente las amígdalas, en donde se encuentran bacterias, intentando evitar el contacto con la lengua u otras zonas. Es normal que se provoque un reflejo de arcada. En este caso, se separa la torunda y se vuelve a intentar.

·         Al finalizar, se tira el depresor al contenedor de desechos orgánicos.

·         Se tapa la torunda y se rotula con el nombre del donante y la fecha, indicando con una F, que se trata de un frotis faríngeo.

·         Siembra  A continuación se toma una placa de agar-sangre y se procede a la siembra del material recogido con la torunda o  Hisopo. Se extrae la funda de la torunda y se pasa SUAVEMENTE por la superficie, cubriendo el área  al finalizar, se tira el hisopo  al contenedor de desechos orgánicos.

Aislamiento

Para intentar que las colonias crezcan separadas tomamos un asa de siembra y se realizan resiembras en dos zonas: (B) Tocando con el asa la zona (A) se realiza una  línea zig-zagueante SUAVEMENTE  sobre la superficie (no hay que perforar la superficie del agar-sangre)  (C) Sin tocar las anteriores zonas. Se tapa y se sella la placa con cinta adhesiva o se rotula la tapa indicando el nombre del donante, su grupo-clase la fecha y la F (de frotis faríngeo).

Incubación y observación

Se llevan las placas a incubar a 37ºC (temperatura corporal), durante 24 horas. Tras este período se recogen las placas y SIN ABRIR se observa el crecimiento bacteriano.

Al finalizar la práctica se entregan las placas al profesor para que sean destruidas junto con el resto de material empleado.

El medio de cultivo agar-sangre es un medio nutritivo general, no selectivo, en el cual pueden crecer casi todos los tipos de microorganismos. Su nombre deriva de que contiene un 5-10% de sangre desfibrinada (no coagula) extraída de caballo, conejo o, sobre todo, de carnero.

Las bacterias existentes en la faringe pueden ser de dos tipos:

·         Flora bacteriana propia o normal, de vida saprofita (crecen sobre restos de comida).

·         Flora patógena, que provoca enfermedades (especialmente Streptococcus pyogenes, responsable de la faringitis aguda, la fiebre reumática, angina estreptocócica, escarlatina, erisipela)

Al tomar una muestra de la faringe, las bacterias existentes empiezan a dividirse. De una bacteria se forman miles o millones, dando lugar a una colonia, visible a simple vista. Todas las bacterias de una colonia son genéticamente idénticas a la bacteria que las originó e iguales entre sí.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

A) REACCIONES POSITIVAS EN DISTINTOS MEDIOS

GELOSA SANGRE

Para el aislamiento, cultivo y detección de actividad hemolítica de Staphylococcus, Streptococcus y otros microorganismos fastidiosos. Se observan colonias blancas casi grises, Grandes, convexas de consistencia butirácea, Presentan bordes regulares. Se observa que Presenta hemólisis.  Las colonias en medio sólido son redondeadas, uniformes, Estos crecen rápidamente a 37 C pero tienden a formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20C).

MANITOL SAL AGAR  (MSA)

Se utiliza como medio selectivo, para cultivar y enumerar especies clínicas de estafilococos El manitol cuando es utilizado por los microorganismos, vira de su color original  rojo a amarillo.  Se observan colonias chicas, blancas, convexas, de consistencia butirácea , presentan bordes irregulares. S. aureus  Manitol sal Colonia amarilla S. epidermidis  Manitol sal Colonia incolora

AGAR VOGEL  Y JONSON (AVJ)

Para la detección de Staphylococcus aureus coagulasa-positivo, se observan colonias negras Pequeñas. bordes irregulares con halo amarillo. Para  S. epidermidis y otros Pequeñas, negro-grisáceos, sin halo,  El medio presenta un vire de rojo pálido a amarillo.

ESTAFILOCOCO S110

S110 Colonias blancas un poco amarillentas, Se observan colonias chicas, convexas, De consistencia butirácea y bordes Regulares.

B) DESCRIPCIÓN DEL TIPO DE COLONIAS OBTENIDAS

Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes características:

      FORMA: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa.

      TAMAÑO: grande (más de 3 Mm.), mediana (2-3 Mm.), pequeña (1-2 Mm.)

      COLOR: Reportar el color final después de la incubación

      BORDE: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado

      ELEVACIÓN: plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado  

      SUPERFICIE: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta

RESULTADOS

CUESTIONARIO

1.   ¿Cuándo los microorganismos pueden causar daño en nuestro organismo?

R: Los microorganismos patógenos causan infecciones. La infección es el ataque de los microorganismos a un ser vivo hospedador. La virulencia o patogenicidad depende de la capacidad que tenga el patógeno de producir una enfermedad.

2.   ¿Qué tipo de bacterias son encontradas con mayor frecuencia en nuestra piel y que pretenden aislarse en esta práctica?

R: La bacterias predominante son staphyloccocus y que se encuentra normalmente en nuestra piel y se pretende aislar en esta practicas bacterias staphyloccocus aureus.

3.   ¿Qué finalidad tiene humedecer el hisopo con solución salina estéril?

R: El hisopo se humedece son solución salina para que entre en mejor contacto al tomar muestra de la piel o faringe. Para que se consiga mayor pureza de cultivo y se disemine bien sobre la superficie del agar.

4.   ¿Por qué no es recomendable utilizar el mismo hisopo para descargar en las cinco cajas de Petri con los medios ya preparados?

R: no se recomienda utilizar el mismo hisopo para las cinco cajas de Petri porque puede que esté contaminada y se requiere que para cada preparado este esterilizada.

5.   ¿Por qué se recomienda enfriar el asa de platino en el medio de cultivo ya preparado antes de realizar el sembrado por estrías de los microorganismos?

R: Se deja enfriar el asa de platino antes de realizar el sembrado porque alta temperatura puede alterar la estructura de la bacteria.

6.   ¿En qué consiste el aislamiento por estrías?

R: El propósito de esta técnica es diluir el inoculo los suficiente sobre la superficie del agar para poder obtener colonias bacteriana bien aisladas a partir de unidades formadoras de colonias.

7.   Después de haber incubado a 37° C por 48 horas describe las colonias obtenidas en cada medio de cultivo utilizado

Tipo de Cultivo	Agar McConckey
Forma	Puntiforme
Elevación	plano
Color	Amarillo

Tipo de Cultivo	Agar Manitol sal
Forma	Puntiforme, circular
Elevación	Entero
Color	Amarillo

Tipo de Cultivo	Agar Sangre
Forma	Irregular
Borde	Ondeado
Color	Café

CONCLUSIÓN

Durante los cultivos que realizamos pudimos observar que en nuestro organismo existen bacterias, en la cual se demostró que en la piel tenemos defensa contra los efectos de estos microorganismos que se encuentran alrededor, lo que hay que mantener una buena higiene y saber eliminar los desechos para evitar la contaminación.