Universidad Latina De Panamá
Facultad Ciencias De La Salud
Licenciatura en Farmacia
¨Tinción De Gram¨
III Cuatrimestre
Profesor Ricardo Vizuete
Integrantes:
Alicia Cheung
Katiuska Guan
Mileika Lineth
Ariel Ledezma
Maribel Len
Isabel Luo
Juan Montes
Magda Rodriguez
Magda Rodriguez
Nayeli Garcias
Melissa Wan
Yamilka Yau
Tinción de Gram
INTRODUCCIÓN
TINCIÓN DE
GRAM.
Tinción empleada en microbiología
para la visualización de bacterias en muestras clínicas. También se emplea como primer
paso en la diferenciación bacteriana. El examen con microscopio óptico de
preparación con tinción de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de
las bacterias. Las formas comunes son cocos ( esféricas), bacilos (alargadas) y
formas espiraladas
Las bacterias pueden diferenciarse
con esta tinción en dos grupos. Los microorganismos Gram. positivos se tiñen de azul, mientras que
aproximadamente un tercio de los cocos,
la mitad de los bacilos y todos los organismos espiralados se tiñen de rojo y se dice que son
gramnegativos.
Las
aplicaciones más comunes de la
coloración de Gram son las siguientes:
La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere
estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los
diplococos
La presencia de diplococos gramnegativos son características
de especies de Neisseria
Los bacilos Gram. positivos grandes sugieren especies de Bacillus o
clostridium, los bacilos Gram.
positivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las
corineiformes ( difteroides)
Los
bacilos Gram. negativos son las bacterias
mas comunes halladas en los laboratorios clínicos e incluyen a
Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y
especies de Haemophilus.
El valor diagnóstico de esta tinción
es variable; normalmente permite una buena orientación al microbiólogo para
seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y también tiene valor en
orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar un
tratamiento inicial.
OBJETIVO
El alumno aplicará
una técnica de coloración diferencial para la
identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas.
MATERIAL
- Asa de platino
- Microscopio
- Porta objetos
- Aceite de inmersión
- Esputo de tuberculoso procesado en autoclave
- Cultivos de Escherichia coli
- Cultivo de Staphylococcus aureus
- Cultivo de Cándida albicans
SUSTANCIAS COLORANTES
- Colorante violeta cristal de Gram
- Solución decolorante alcohol acetona
- Safranina de Gram
- Yodo de Gram o lugol para gram
PROCEDIMIENTO
REALIZACIÓN DEL FROTIS
- Colocar una pequeña gota de agua en el centro
de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo
que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su
filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.
- Flamear el asa de siembra, tomar, en
condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en
medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el
asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante
extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en
medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que
basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se
toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
- Esperar hasta que el líquido se evapore o
acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este
caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues
las células pueden deformarse o romperse.
A)
TINCIÓN DE GRAM
- Realiza la preparación del frotis bacteriano como se explicó en el paso anterior
- Teñir con cristal violeta 3 min.
- Lavar con abundante agua el exceso de
colorante.
- Cubrir con
Lugol 1min.
- Lavar con agua el exceso de Lugol.
RESULTADOS
CUESTIONARIO
1.
¿Qué es un frotis?
: Frotis es la realización
de extensión tomando una pequeña cantidad de cultivo bacteriano extendiéndola
sobre un portaobjetos limpio y fijándola.
2.
¿Con que finalidad se fija la muestra de microorganismo en el
porta objetos?
: La fijación de una
extensión bacteriana es imprescindible para que las bacterias queden
inactivadas y adheridas al vidrio. De esta manera, no se pierden en los pasos
de lavado necesarios para la tinción.
3.
¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?
:Es difícil su observación
sin teñir las bacterias. Las tinciones se usan para revelar el tamaño, las
forma y la agrupación de los microorganismos. Para mostrar la presencia de
varias estructuras internas y externas y para producir reacciones físicas y
químicas especificas a las tinciones, ayudar a la identificación de los
microorganismos.
4.
¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la
observación de los microorganismos?
: El
aceite de inmersión es usado para la observación objetivo muy pequeño, como las
muestras individuales de bacterias y para la aplicación de alta resolución.
5.
De los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿Cuál
es el que funciona como colorante primario?
: Se utilizó cristal
violeta, colorante violeta que imparte su color a todas las células como un
colorante primario.
6.
¿Que función tiene el Yodo en la tinción de Gram?
: Se le agregó yodo una
sustancia química a la solución para intensificar la coloración; este aditivo
se denomina mordiente para dar como resultado una coloración violeta oscuro.
7.
¿Qué coloración tiñe las bacterias Gram, positiva?
: Las bacterias que
retienen el cristal violeta después de la decoloración se observan de color
morado y son Gram positiva.
8.
¿Que coloración tiñen las bacterias Gram negativas?
: Las
bacterias Gram negativas por el contrario, pierden el colorante primario por el
tratamiento diferencial y toman el colorante de contraste, se observa entonces
de color rojo.
9.
Menciona tres bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la
enfermedad que causa cada una de ellas.
: Bacteria de Gram
positiva:
·
Bacillus anthracis:
produce
una enfermedad infecciosa debido a un tipo de bacterias llamadas Bacillus
anthracis. La infección en los humanos compromete con mayor frecuencia la
piel, el tracto gastrointestinal o los pulmones.
Ántrax cutáneo (piel): es la forma más frecuente; en Chile el 95% de los casos es de este tipo. El contagio se produce cuando la bacteria toma contacto con un corte o lesión de la piel, al manipular cuero, lana, pelo de animales infectados. Comienza con un granito y picazón parecido a la picadura de un insecto. Pronto se convierte en una úlcera indolora, entre 1 y 3 centímetros de diámetro, generalmente negra en el centro. Los ganglios de la zona cercana se pueden inflamar. Los sitios más frecuentemente comprometidos son la cabeza, antebrazos y manos. Las infecciones no tratadas pueden derivar en una septicemia masiva y en ocasiones causa meningitis. Alrededor de un 20% de los casos que no reciben tratamiento mueren.
|
·
Clostridium
botulinum: causante de la enfermedad botulismo.
El Botulismo del lactante se debe a la acción de la neurotoxina que colonizan el aparato digestivo de los lactantes debido a la ausencia de microorganismos intestinales competidores, puede desarrollar una enf. Progresiva con parálisis fláccida e insuficiencia respiratoria. El botulismo alimentario suele presentar un cuadro de debilidad y mareos 1 a 2 días después del consumo del alimento contaminado, los signos iniciales de la enfermedad son visión borrosa, pupilas fijas y dilatadas, xerostomía y dolor abdominal, en el Botulismo de las heridas la producción de la toxina del Clostridio produce síntomas idénticos al de los alimentos pero el periodo de incubación es más largo de 4 días o mas y los síntomas del aparato digestivo son menos prominentes. |
·
Corynebacterium
diphtheriae: causante de la Difteria respiratoria
Los síntomas de la difteria que afectan al aparato respiratorio se desarrollan después de un periodo de incubación de 2 a 4 días. La bacteria se multiplica en el interior de células epiteliales de la faringe o de superficies adyacentes e inicialmente produce un daño localizado como consecuencia de la actividad de la exotoxina.Comienzo brusco con faringitis exudativa, garganta irritada, febrícula y malestar, se forma una seudomembrana sobre la faringe, en enfermos en estado crítico las complicaciones más significativas son cardiacas y neurológicas. |
10.
Menciona tres bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la
enfermedad que causa cada una de ellas.
: Bacteria de Gram
negativa
·
H. pylori: La bacteria causa
las úlceras pépticas al dañar el revestimiento mucoso que protege el estómago
y el duodeno. El daño al revestimiento mucoso permite que los potentes ácidos
estomacales atraviesen el sensible revestimiento debajo del estómago y
duodeno. Juntos, el ácido estomacal y H. pylori irritan el revestimiento del
estómago y duodeno y causan una úlcera.
|
·
-Haemophilus
influenzae: Esta bacteria causante de las siguientes enfermedades:
1. Meningitis: Fiebre, dolor de cabeza, náusea, vómitos, cuello rígido, sensibilidad a la luz (fotofobia), convulsiones, coma; en niños, pobre alimentación y abultamiento de la fontanela. 2. Epiglotitis: Establecimiento repentino de dolor de garganta, fiebre y cortedad de respiración, que progresa rápidamente a dificultad al tragar, acumulando saliva y babeo debido a la vía aérea obstruida. 3 Neumonía: Dificultad respiratoria severa, taquicardia, fiebre, tos y evidencia de neumonía por rayos X. 4. Artritis Séptica: Edema, calor, dolor al movimiento y movilidad disminuida de una sola articulación mayor. |
·
Brucella:
|
INVESTIGACIÓN
1.
Cuáles son las fuentes de
errores más comunes de error en la tinción de Gram
: Errores comunes en la tinción
de Gram
·
Identificación y toma de la muestra que no las bacterias.
·
Sobrecalentar el portaobjeto, puede distorsionar y causar un
efecto en la muestra
·
Emplear mal las técnicas requerida durante el proceso de tinción
·
Concentración inadecuada de los reactivos de tinción.
·
El tiempo de tinción incorrecto.
2.
Explique que reacción de Gram darán las levaduras. Estas tendrán
la misma importancia que para las bacterias.
: La tinción de Gram tiñe
la levadura, en casi todas son Gram positivo. Son de la misma importancia ya
que las bacteria levaduras también pueden ser infecciosas para el ser humano y
se usan para diagnóstico en laboratorio clínico.
3.
Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la
práctica. Qué tipo de información se obtiene.
R: El
preparado incoloro contra un fondo coloreado se denomina tinción negativa. Una
técnica valiosa para la observación de las formas generales, los tamaños y las
cápsulas celulares resultan muy visibles contra un fondo oscuro que contrasta.
4.
Investiga otra técnica de tinción selectiva que permita observar
otras estructuras bacterianas.
: Tinción de ziehl-neelsen
La
tinción de ziehl neelsen es otro tipo de coloración diferencial que separa los
géneros mycobacterium y nocardia del resto de las bacterias.
En
esta técnica se utiliza fucsina o fenicada como colorante primario, esta
solución se aplica son calentamiento o emisión de vapores. Como agente
decolorante se aplica una mezcla de etanol y ácido sulfúrico o ácido
clorhídrico, el azul de metileno es el colorante secundario.
La
coloración clásica de ziehl-neelsen requiere calentamiento para que el
colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el
calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos
grasos de modo que el colorante a no puede salir de las bacterias. Por otro lado,
el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo
cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la
decoloración son de color rojo y las que no se ven de color azul ya que se
utiliza azul de metileno como tinción de contraste.
5.
¿A qué se debe el distinto comportamiento de las bacterias según
se Gram + o Gram-?
R: La capa de
peptidoglucano de la pared celular bacteriana, juegan un papel fundamental en
la coloración: el cristal violeta y el lugar, forma una laca en el interior de
las bacterias. Al aplicar el agente decolorante.
En
las bacterias Gram positivas sufren una deshidratación y la red de
peptidoglucano que es muy abundante, se condensa y constituye un obstáculo para
la salida del complejo cristal violeta-lugol (yodo).
Las
bacterias Gram negativas también posee peptidoglucano pero menos cantidad por
lo que constituye una barrera laxa, de modo que las bacterias quedan más
permeable que las Gram positivas y el complejo cristal violeta-lugol (yodo)
sale con más facilidad dejando lugar a la safranina. .
6.
¿Para qué se necesita el aceite de inmersión?
: El aceite de inmersión
para microscopio tienen el mismo índice de refracción que el vidrio. Mediante
el aceite de inmersión se elimina completamente la desviación de los rayos de
la luz y aumenta con eficacia los objetos de los microscopios.
CONCLUSIÓN
La
tinción empleada en microbiología para
la visualización de bacterias en muestras clínicas. Se emplean para la diferenciación
bacterianas, esta preparación con tinción de Gram se emplean para la determinar
la forma de las bacterias, las formas comunes son cocos (esféricos), bacilos (alargadas)
y forma espiraladas. Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos
grupos. Los microorganismos Gram positivas se tiñen de azul, mientras que las Gram
negativas son de rojo. Es pues de importancia la tinción de Gram emplear métodos de coloración de las bacterias
para identificación y taxonomía de las bacterias.
